CCDC109B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412415-ACT

MCUB (CCDC109B) kodiert eine regulatorische Untereinheit des mitochondrialen Calcium-Uniporter-Komplexes, die den Ca2+-Einstrom über die innere Mitochondrienmembran moduliert und dazu beiträgt, die mitochondriale Bioenergetik sowie Ca2+-abhängige Signalwege fein abzustimmen. Indem CCDC109B als negativer Regulator der MCU-Kanalaktivität wirkt, beeinflusst es die oxidative Phosphorylierung, das Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies und die Kopplung zwischen zytosolischen Ca2+-Transienten und dem mitochondrialen Stoffwechsel. Eine veränderte Regulation des Uniporters wurde mit fehlregulierten zellulären Stressantworten und einer Umgestaltung der mitochondrialen Dynamik in Verbindung gebracht – Prozesse, die für proliferative und neurodegenerative Phänotypen relevant sind. In humanen Zellen wird MCUB/CCDC109B daher im Kontext der mitochondrialen Ca2+-Homöostase, der metabolischen Reprogrammierung und Ca2+-gesteuerter Transkriptionsprogramme untersucht.

CCDC109B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MCUB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CCDC109B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MCUB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MCUB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CCDC109B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MCUB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CCDC109B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CCDC109B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MCUB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.