Plasmide CRISPR d'Activation (h) CBP80: sc-403736-ACT

NCBP1 code pour la sous-unité CBP80 du complexe humain de liaison à la coiffe (cap-binding complex), un composant central du complexe nucléaire de liaison à la coiffe qui reconnaît la coiffe 7‑méthylguanosine des transcrits naissants produits par l’ARN polymérase II. CBP80 coordonne plusieurs étapes de la biogenèse des ARNm, notamment l’épissage des pré‑ARNm, la maturation de l’extrémité 3′, l’export nucléaire et le cycle pionnier de traduction, et interagit avec des voies de surveillance telles que la dégradation des ARNm médiée par les codons stop prématurés (NMD). Par ces activités, NCBP1 relie la production transcriptionnelle au contrôle qualité des ARN et au maintien de l’homéostasie du protéome, dans des états cellulaires prolifératifs comme différenciés. La dérégulation du traitement et de l’export des ARN dépendants de la coiffe est largement impliquée dans des programmes transcriptionnels oncogéniques et des phénotypes neurodéveloppementaux, faisant de CBP80 un nœud pertinent pour étudier le métabolisme des ARN dans des modèles liés aux maladies.

CBP80 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NCBP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CBP80 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NCBP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NCBP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CBP80. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NCBP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CBP80 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CBP80 dans les cellules tumorales présentant une expression de NCBP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.