Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cbl: sc-400561-ACT

Le gène CBL humain code Cbl, une ligase E3 de l’ubiquitine et protéine adaptatrice qui régule négativement les tyrosine kinases de récepteurs et non réceptrices activées en favorisant leur ubiquitination et leur trafic endocytique. Grâce à ses domaines TKB et doigt RING, Cbl module le flux de signalisation dans les voies de l’EGFR, du PDGFR et des récepteurs immunitaires, façonnant les sorties MAPK/ERK, PI3K–AKT et JAK/STAT qui contrôlent la prolifération, la différenciation et les réponses aux cytokines. CBL intègre des rétrocontrôles négatifs dans la signalisation des cellules hématopoïétiques et immunitaires et contribue à la régulation de la dynamique du cytosquelette et de la migration cellulaire. La dérégulation de CBL, notamment une expression altérée ou des variants fonctionnels, est associée à une signalisation anormale des tyrosine kinases dans les cancers et les troubles liés à l’immunité, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques de l’atténuation des signaux.

Cbl Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CBL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cbl Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CBL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CBL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cbl. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CBL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cbl au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cbl dans les cellules tumorales présentant une expression de CBL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.