Plasmide CRISPR d'Activation (m) cathepsin L: sc-419880-ACT

Le gène murin **Ctsl** code la **cathepsine L**, une protéase cystéine lysosomale qui assure le renouvellement des protéines intracellulaires en clivant les cargaisons endocytées et autophagiques après leur acheminement vers des compartiments endolysosomaux acides. La cathepsine L contribue au traitement des antigènes pour leur présentation par le **CMH de classe II**, au remodelage de la matrice extracellulaire après sécrétion, ainsi qu’à la régulation protéolytique de protéines de signalisation, ce qui l’inscrit au croisement de la modulation immunitaire et de l’homéostasie tissulaire. L’activité de **Ctsl** s’articule avec les voies lysosome–autophagie, la maturation des phagosomes et des réseaux de protéases qui façonnent la protéostasie et les décisions de destin cellulaire. Une dérégulation de la cathepsine L a été associée à des processus inflammatoires, à des remodelages liés à la fibrose et à des phénotypes d’invasion tumorale, faisant de **Ctsl** une cible pertinente pour des études mécanistiques de la biologie dépendante des protéases.

cathepsin L Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ctsl sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cathepsin L Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ctsl dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ctsl, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cathepsin L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ctsl natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cathepsin L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cathepsin L dans les cellules tumorales présentant une expression de Ctsl silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.