Plasmide CRISPR d'Activation (h) cathepsin L: sc-400804-ACT

Le gène humain **CTSL** code la cathepsine L, une protéase cystéine lysosomale qui intervient dans le renouvellement intracellulaire des protéines et la maturation des peptides au sein du système endolysosomal. La cathepsine L contribue au flux autophagie–lysosome, au remodelage de la matrice extracellulaire après sa sécrétion, ainsi qu’à des événements d’activation protéolytique qui recoupent le traitement des antigènes et la signalisation inflammatoire. Une activité de **CTSL** dérégulée a été associée à des modifications de l’invasion et des métastases des cellules tumorales, au remodelage lié à la fibrose, ainsi qu’à des processus d’entrée de pathogènes dépendant de l’activité des protéases endosomales. En tant que composant nodal de la protéostasie et des voies dépendantes du lysosome, **CTSL** est fréquemment étudié dans des contextes reliant les réponses cellulaires au stress à la régulation immunitaire et au remodelage tissulaire.

cathepsin L Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CTSL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cathepsin L Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CTSL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CTSL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cathepsin L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CTSL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cathepsin L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cathepsin L dans les cellules tumorales présentant une expression de CTSL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.