cathepsin L Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400804-ACT

O CTSL humano codifica a catepsina L, uma protease cisteína lisossomal que medeia a renovação intracelular de proteínas e o processamento de peptídeos no sistema endolisossomal. A catepsina L contribui para o fluxo autofagia–lisossomo, para a remodelação da matriz extracelular após secreção e para eventos de ativação proteolítica que se cruzam com o processamento de antígenos e a sinalização inflamatória. A atividade desregulada de CTSL tem sido associada a alterações na invasão e metástase de células tumorais, à remodelação relacionada à fibrose e a processos de entrada de patógenos que dependem da atividade de proteases endossomais. Como um componente nodal da proteostase e de vias dependentes de lisossomos, o CTSL é frequentemente estudado em contextos que conectam respostas celulares ao estresse à regulação imune e à remodelação tecidual.

cathepsin L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CTSL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cathepsin L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CTSL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CTSL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cathepsin L. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CTSL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cathepsin L no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cathepsin L em células tumorais com expressão de CTSL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.