cathepsin H CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402601-ACT

CTSH kodiert Cathepsin H, eine lysosomale Cysteinprotease, die sowohl Endopeptidase- als auch Aminopeptidase-Aktivität aufweist und damit zum intrazellulären Proteinumsatz sowie zur Peptidverarbeitung beiträgt. Cathepsin H ist an der lysosomenabhängigen Proteolyse beteiligt und steht in Verbindung mit endo-lysosomalen Transportwegen, die die Antigenprozessierung, den Umbau der extrazellulären Matrix und zelluläre Stressantworten beeinflussen. Eine veränderte CTSH-Expression oder -Aktivität wurde mit dysregulierten Proteasenetzwerken bei Entzündungen, Neurodegeneration und krebsassoziierten Prozessen in Zusammenhang gebracht, bei denen Veränderungen der Lysosomenfunktion Invasion, Überleben und Immun-Signalgebung beeinflussen können. Daher wird CTSH häufig im Kontext von Proteostase, der Biologie des Tumormikromilieus und der Regulation lysosomenzentrierter Signalwege untersucht.

cathepsin H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CTSH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cathepsin H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CTSH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CTSH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cathepsin H-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CTSH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cathepsin H-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cathepsin H-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CTSH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.