Plasmide CRISPR d'Activation (h) CAT-1: sc-403628-ACT

Le gène humain SLC7A1 code le transporteur d’acides aminés cationiques 1 (CAT-1), un transporteur de la membrane plasmique à haute affinité qui assure l’absorption de la L-arginine, de la L-lysine et de la L-ornithine. En régulant la disponibilité intracellulaire de l’arginine, CAT-1 influence la synthèse d’oxyde nitrique, la biosynthèse des polyamines et, plus largement, des programmes de détection des acides aminés qui modulent la croissance cellulaire, l’équilibre rédox et la signalisation immunitaire. L’activité de CAT-1 recoupe des voies endothéliales et inflammatoires via l’apport en substrat nécessaire à la signalisation dépendante des NOS et au métabolisme de l’arginine. Une expression dérégulée de SLC7A1 ou une capacité de transport altérée ont été associées à des dysfonctions vasculaires, à des phénotypes cardiométaboliques et à des états prolifératifs modifiés, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques sur le transport des acides aminés et les interconnexions de la signalisation.

CAT-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC7A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CAT-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC7A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC7A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CAT-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC7A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CAT-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CAT-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC7A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.