Plásmido CRISPR de Activación (m) calsequestrin 1: sc-419471-ACT

Mouse Casq1 codifica calsecuestrina 1, una proteína luminal del retículo sarcoplásmico de alta capacidad de unión a Ca²⁺ que amortigua el Ca²⁺ y ayuda a modular el acoplamiento excitación–contracción en el músculo esquelético de contracción rápida. Al organizar el almacenamiento y la liberación de Ca²⁺ en coordinación con la señalización del receptor de rianodina y la maquinaria del RS encargada del manejo iónico, CASQ1 contribuye a la homeostasis del calcio, al rendimiento contráctil y a la adaptación dependiente de la actividad. Las alteraciones en la función o la expresión de CASQ1 se asocian con una desregulación de la dinámica intracelular de Ca²⁺, una mayor susceptibilidad al daño de las miofibras inducido por el estrés y fenotipos de fisiología muscular relevantes para estudios de miopatías y respuestas similares a la hipertermia maligna. Por lo tanto, Casq1 proporciona una herramienta útil para investigar el amortiguamiento de Ca²⁺ en el RS, la señalización dependiente de Ca²⁺ y los mecanismos de enfermedad del músculo esquelético en modelos murinos y sistemas celulares modificados.

calsequestrin 1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Casq1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

calsequestrin 1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Casq1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Casq1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de calsequestrin 1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Casq1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de calsequestrin 1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía calsequestrin 1 en células tumorales con expresión de Casq1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.