Plasmide CRISPR d'Activation (h) Calpain reg: sc-403478-ACT

CAPNS1 code la petite sous-unité régulatrice indispensable à la stabilité et à l’activité des protéases ubiquitaires calpaïne‑1 et calpaïne‑2, permettant une protéolyse limitée et dépendante du calcium de protéines de signalisation et de structure. Par un clivage contrôlé des substrats, l’activité des calpaïnes soutenue par CAPNS1 module le remodelage du cytosquelette, le renouvellement des adhésions focales, la migration cellulaire et la progression du cycle cellulaire, et s’articule avec les programmes de protéostasie et de réponse au stress. La signalisation des calpaïnes influence également les voies inflammatoires et apoptotiques en remodelant des régulateurs clés, reliant la fonction de CAPNS1 à des processus pertinents pour la biologie tumorale, la neurodégénérescence et les modèles de lésions tissulaires. Une expression altérée de CAPNS1 ou une dérégulation des calpaïnes a été associée à des modifications de l’invasivité cellulaire, de l’intégrité des barrières et de la sensibilité au stress protéotoxique, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques.

Calpain reg Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CAPNS1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Calpain reg Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CAPNS1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CAPNS1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Calpain reg. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CAPNS1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Calpain reg au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Calpain reg dans les cellules tumorales présentant une expression de CAPNS1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.