Plasmide CRISPR d'Activation (h) Calpain 5: sc-403881-ACT

CAPN5 code la calpaïne 5, une protéase à cystéine dépendante du calcium impliquée dans la protéolyse régulée qui façonne la dynamique du cytosquelette, le trafic membranaire et la transduction du signal. L’activité des calpaïnes peut influencer des voies liées à la motilité cellulaire, à l’adhérence et aux réponses au stress via le clivage limité de protéines structurales et de signalisation. Une dérégulation de la fonction protéasique des calpaïnes a été associée à des processus inflammatoires et neurodégénératifs, et les variations de CAPN5 ont été étudiées en lien avec des phénotypes de dégénérescence rétinienne. La modulation de l’expression de CAPN5 est donc utile pour disséquer les événements de remodelage pilotés par des protéases et les programmes de signalisation sensibles au calcium dans les cellules humaines.

Calpain 5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CAPN5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Calpain 5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CAPN5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CAPN5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Calpain 5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CAPN5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Calpain 5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Calpain 5 dans les cellules tumorales présentant une expression de CAPN5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.