Plasmide CRISPR d'Activation (h) CA VIII: sc-403750-ACT

Le gène humain **CA8** code l’anhydrase carbonique VIII (CA VIII), une protéine apparentée aux anhydrases carboniques mais dépourvue d’activité catalytique, qui module la signalisation neuronale plutôt que l’hydratation du CO₂. CA VIII est fortement enrichie dans le système nerveux central et régule la dynamique du calcium intracellulaire via son interaction avec les voies du récepteur de l’inositol 1,4,5‑trisphosphate, influençant l’excitabilité des cellules de Purkinje et la fonction synaptique. Des altérations de l’expression ou de la fonction de CA8 ont été associées à des phénotypes de neurodéveloppement et de coordination motrice, ce qui souligne sa pertinence pour les circuits cérébelleux et les réseaux de signalisation dépendants du calcium. En tant que membre non enzymatique de la famille des CA, CA VIII constitue également un modèle pour disséquer les rôles de type « échafaudage » des pseudoenzymes dans la signalisation cellulaire.

CA VIII Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CA8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CA VIII Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CA8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CA8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CA VIII. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CA8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CA VIII au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CA VIII dans les cellules tumorales présentant une expression de CA8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.