C1orf68 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403506-ACT

Humanes C1orf68 (Chromosom 1 Open Reading Frame 68) kodiert ein bislang nur unzureichend charakterisiertes Protein mit begrenzter funktioneller Annotation; zugleich gibt es zunehmende Hinweise auf eine kontextabhängige Expression in verschiedenen Geweben und Krankheitszuständen. Obwohl die zugrunde liegenden molekularen Signalwege noch nicht vollständig aufgeklärt sind, deuten transkriptbasierte Studien darauf hin, dass C1orf68 an zellulären Programmen beteiligt sein könnte, die mit Differenzierung, Stressantworten und der Regulation von Genexpressionsnetzwerken verknüpft sind. In mehreren Omics-Datensätzen wurden veränderte Expressionsmuster beschrieben, was C1orf68 als Kandidatengen für mechanistische Studien zur Signalübertragung und transkriptionellen Kontrolle in krankheitsrelevanten Zellmodellen unterstützt. Die Untersuchung von C1orf68 kann dazu beitragen zu klären, wie wenig erforschte Open-Reading-Frame-Gene zum Umbau von Signalwegen und zur phänotypischen Variation beitragen.

C1orf68 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen C1orf68-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

C1orf68 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des C1orf68-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der C1orf68-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen C1orf68-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native C1orf68-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von C1orf68-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des C1orf68-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem C1orf68-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.