BUB1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402006-ACT

BUB1 kodiert eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentrale Komponente des Spindelkontrollpunkts (Spindle Assembly Checkpoint) fungiert und während der Mitose die korrekte Ausrichtung und Segregation der Chromosomen koordiniert. Das Protein lokalisiert an den Kinetochoren und trägt dazu bei, Kontrollpunkt-Proteine wie BUB3, MAD1/2 und CDC20 zu rekrutieren und zu regulieren, um den Beginn der Anaphase zu steuern und die genomische Stabilität aufrechtzuerhalten. Über seine Funktionen bei der Kinetochor–Mikrotubuli-Anheftung und der Kontrollpunkt-Signalgebung verknüpft BUB1 das Timing der Mitose mit Fehlerkorrekturwegen, die Aneuploidie verhindern. Eine fehlregulierte Expression oder Aktivität von BUB1 wurde mit Phänotypen chromosomaler Instabilität in verschiedensten Krebsmodellen in Verbindung gebracht, was BUB1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Mitosekontrolle, Proliferation und Mechanismen der Genom-Erhaltung macht.

BUB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BUB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BUB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BUB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BUB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BUB1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BUB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BUB1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BUB1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BUB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.