Plasmide CRISPR d'Activation (h) BRWD3: sc-415190-ACT

Le gène humain BRWD3 code une protéine associée à la chromatine contenant un bromodomaine et des répétitions WD, qui participe à la régulation épigénétique de la transcription en couplant la reconnaissance des lysines acétylées au remodelage de la chromatine et aux processus dépendant de l’ADN comme matrice. Grâce à ses bromodomaines et à ses répétitions WD jouant un rôle d’échafaudage, BRWD3 est impliquée dans le contrôle de programmes d’expression génique qui influencent la prolifération cellulaire, la différenciation et la stabilité du génome. Des études génétiques et fonctionnelles ont établi un lien entre la dérégulation de BRWD3 et des phénotypes neurodéveloppementaux, notamment une déficience intellectuelle liée à l’X, ainsi qu’avec des perturbations transcriptionnelles plus larges pertinentes pour la biologie du cancer. BRWD3 constitue donc un nœud d’intérêt pour étudier le contrôle des voies dépendantes de la chromatine et les relations génotype‑phénotype dans les cellules humaines.

BRWD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BRWD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BRWD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BRWD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BRWD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BRWD3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BRWD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BRWD3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BRWD3 dans les cellules tumorales présentant une expression de BRWD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.