BETA 3 CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-425594-ACT-2

Das Mausgen Bhlhe22 kodiert den basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor BETA3, einen Regulator der neuronalen Differenzierung und Reifung, der während der Entwicklung des zentralen Nervensystems zur Ausprägung von Genexpressionsprogrammen beiträgt. BETA3 moduliert über bHLH-vermittelte DNA-Bindung und die Interaktion mit entwicklungsbiologischen Signalwegen, die den Übergang von Vorläuferzellen zu Neuronen koordinieren, Transkriptionsnetzwerke, die mit Zellschicksalsfestlegung, Neuritenauswachsung und synaptischer Organisation verknüpft sind. Veränderte Bhlhe22-Aktivität wurde in der Literatur mit gestörter kortikaler Verschaltung und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was das Gen für die Untersuchung von Mechanismen der Gehirnentwicklung und der Biologie neurologischer Erkrankungen relevant macht. Das Gene Editing von Bhlhe22 in Mausmodellen ermöglicht die funktionelle Analyse von Linienentscheidungen, Schaltkreisaufbau und nachgeschalteten transkriptomischen Veränderungen in primären Neuronen, Organoiden oder in vivo in entwicklungsbiologischen Kontexten.

BETA 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Bhlhe22-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BETA 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Bhlhe22-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Bhlhe22-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BETA 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Bhlhe22-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BETA 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BETA 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Bhlhe22-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.