Bestrophin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404183-ACT

ヒトBEST1遺伝子は、Ca2+活性化アニオンチャネルであるベストロフィン-1をコードしており、主に網膜色素上皮（RPE）の基底側膜に局在します。ベストロフィンは、塩化物イオンおよび重炭酸イオンのフラックス、上皮におけるイオン・体液恒常性、ならびに経上皮輸送過程を支える膜コンダクタンスへと細胞内Ca2+シグナルを結び付ける機能に寄与します。BEST1の活性は、イオン性微小環境の調節を介して、膜電位、細胞容積、網膜代謝を制御する経路とも交差します。BEST1の遺伝的変異や発現制御の破綻は遺伝性網膜疾患と関連しており、細胞モデルにおいてRPE生理や網膜変性の機序を研究する上で有用な標的となります。

Bestrophin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性BEST1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Bestrophin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における BEST1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はBEST1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Bestrophinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のBEST1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるBestrophin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびBEST1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるBestrophin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。