Plasmide CRISPR d'Activation (h) Bcl-2: sc-400025-ACT

BCL2 code pour Bcl-2, une protéine intégrale de la membrane externe mitochondriale qui inhibe l’apoptose en empêchant la perméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie et en limitant la libération du cytochrome c. En séquestrant des protéines pro-apoptotiques de type BH3-only et en s’opposant à l’activation de BAX/BAK, Bcl-2 constitue un nœud central de la voie intrinsèque de l’apoptose et module les réponses cellulaires au stress, au retrait de facteurs de croissance et aux dommages de l’ADN. L’activité de BCL2 s’entrecroise avec des réseaux de signalisation pro-survie, notamment les voies PI3K–AKT et MAPK, et influence la dynamique mitochondriale ainsi que l’homéostasie redox. Une expression dérégulée de BCL2 est fréquemment associée à une diminution de l’« amorçage » apoptotique dans le cancer et contribue à la survie anormale de populations de cellules malignes et immunitaires, ce qui en fait une cible largement pertinente pour les études sur l’oncogenèse, la réponse aux traitements et l’homéostasie immunitaire.

Bcl-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BCL2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Bcl-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BCL2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BCL2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Bcl-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BCL2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Bcl-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Bcl-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de BCL2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.