Plasmide CRISPR d'Activation (h) Barttin: sc-404023-ACT

Le gène humain **BSND** code la barttine, une sous-unité accessoire essentielle des canaux chlorure **CLCNKA** et **CLCNKB**, qui favorise leur adressage, leur stabilité et leur conductance au chlorure à la membrane plasmique. Le transport de Cl⁻ dépendant de la barttine est crucial pour l’homéostasie ionique épithéliale dans le rein et l’oreille interne, reliant **BSND** à la gestion transépithéliale du sel et à l’équilibre ionique de l’endolymphe. En régulant la fonction des canaux chlorure, la barttine contribue à des gradients électrochimiques qui influencent les processus de transport couplé Na⁺/K⁺ et l’équilibre hydrique. La dysrégulation de **BSND** est associée à des phénotypes héréditaires de perte de sel et de surdité neurosensorielle, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des mécanismes de transport épithélial et des relations génotype–phénotype.

Barttin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BSND sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Barttin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BSND dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BSND, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Barttin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BSND natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Barttin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Barttin dans les cellules tumorales présentant une expression de BSND silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.