Bak CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400646-ACT

Das humane BAK1-Gen kodiert Bak, einen proapoptotischen Effektor der BCL-2-Familie, der in der äußeren Mitochondrienmembran oligomerisiert und während der intrinsischen Apoptose die Freisetzung von Cytochrom c sowie die Aktivierung von Caspasen fördert. Bak integriert Stresssignale wie DNA-Schäden, ER-Stress und Entzug von Wachstumsfaktoren über BH3-only-Proteine und wirkt dabei zusammen mit BAX, um die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran auszuführen. Eine veränderte BAK1-Aktivität kann das Gleichgewicht zwischen Überleben und programmiertem Zelltod verschieben und dadurch die Tumorbiologie, die Immunhomöostase und Reaktionen auf Gewebeschädigung beeinflussen. Als zentraler Regulator der Apoptose ist Bak Gegenstand umfangreicher Forschung zu Signalwegen, die die mitochondriale Integrität, zelluläre Stresssignalgebung und die Empfindlichkeit gegenüber proapoptotischen Stimuli steuern.

Bak Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BAK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Bak Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BAK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BAK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Bak-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BAK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Bak-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Bak-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BAK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.