Bad Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400419-ACT

O gene humano BAD (BCL2 associated agonist of cell death) codifica a proteína Bad, um membro pró-apoptótico do tipo BH3-only da família BCL-2 que integra sinais de sobrevivência e de morte nas mitocôndrias. Bad promove a permeabilização da membrana externa mitocondrial ao se ligar e neutralizar proteínas antiapoptóticas como BCL-2 e BCL-XL, facilitando assim a ativação de BAX/BAK e a apoptose dependente de caspases. Sua atividade é rigidamente regulada por fosforilação e sequestro a jusante das vias de sinalização PI3K/AKT e MAPK, conectando a sinalização por fatores de crescimento à apoptose intrínseca e ao controle metabólico. A desregulação da sinalização de BAD tem sido implicada em limiares apoptóticos alterados, relevantes para a biologia do câncer, neurodegeneração e respostas ao estresse.

Bad O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BAD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Bad O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BAD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BAD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Bad. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BAD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Bad no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Bad em células tumorais com expressão de BAD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.