Plasmide CRISPR d'Activation (m) B7-2: sc-419575-ACT

Le gène murin *Cd86* code la protéine co-stimulatrice B7-2, membre de la superfamille des immunoglobulines, un ligand de surface des cellules présentatrices d’antigènes qui interagit avec CD28 et CTLA-4 afin de moduler l’activation des lymphocytes T, leur prolifération et la production de cytokines. B7-2 participe à la formation de la synapse immunologique et s’intègre à la signalisation du récepteur de l’antigène pour façonner les réponses immunitaires adaptatives, notamment la polarisation des Th et les mécanismes de tolérance. Des modifications de l’expression de CD86 sont couramment utilisées comme indicateur de l’activation des cellules dendritiques et des macrophages, et sont impliquées dans la biologie des maladies inflammatoires et auto-immunes ainsi que dans l’immunologie des tumeurs via la modulation des signaux de checkpoints.

B7-2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cd86 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

B7-2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cd86 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cd86, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de B7-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cd86 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de B7-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie B7-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cd86 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.