Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP7A: sc-402387-ACT

ATP7A code une ATPase de type P transportant le cuivre, qui régule la distribution intracellulaire du cuivre en l’exportant du cytosol et en l’acheminant vers la voie sécrétoire afin de permettre la métallation des cuproenzymes. En contrôlant l’efflux et le trafic du cuivre, ATP7A contribue à l’homéostasie redox, aux réponses mitochondriales et au stress oxydatif, ainsi qu’à la maturation enzymatique au sein de l’appareil de Golgi. Une activité d’ATP7A dérégulée perturbe l’équilibre du cuivre et affecte des processus tels que la formation du tissu conjonctif et la signalisation neurodéveloppementale, via une altération de la fonction des cuproenzymes. Par conséquent, ATP7A est largement étudiée dans des modèles de troubles du métabolisme du cuivre et de voies de stress cellulaire liées à l’activité enzymatique dépendante du cuivre.

ATP7A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP7A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP7A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP7A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP7A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP7A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP7A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP7A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP7A dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP7A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.