Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP6H: sc-411234-ACT

ATP6V0E1 code pour l’ATP6H, un composant essentiel du domaine V0 de l’ATPase vacuolaire à protons (V-ATPase), qui assure la translocation des protons nécessaire à l’acidification des endosomes, des lysosomes et des vésicules de sécrétion. En contrôlant le pH des organites, l’activité de la V-ATPase régule l’endocytose médiée par les récepteurs, le tri et la dégradation des protéines, le flux autophagique, ainsi que le trafic membranaire lié à mTOR et à la signalisation dépendante des lysosomes. Une perturbation des sous-unités de la V-ATPase dérègle l’homéostasie vésiculaire et peut modifier la présentation antigénique, le chargement des neurotransmetteurs et le métabolisme cellulaire. Une acidification vésiculaire et une fonction lysosomale dérégulées sont impliquées dans l’adaptation des cellules cancéreuses, des phénotypes neurodégénératifs et des dysfonctions immunitaires, ce qui fait d’ATP6V0E1 un point d’entrée pertinent pour l’étude des voies endolysosomales.

ATP6V0E1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V0E1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP6V0E1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V0E1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V0E1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP6V0E1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V0E1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP6V0E1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP6V0E1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V0E1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.