Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP6E: sc-404046-ACT

L’ATP6V1E1 humain code la sous-unité E1 (ATP6E) du domaine périphérique V1 de la H+-ATPase vacuolaire (V-ATPase), une pompe à protons multisous-unités qui assure l’acidification des endosomes, des lysosomes, de l’appareil de Golgi et des vésicules de sécrétion, dépendante de l’ATP. En régulant le pH des organites, la V-ATPase soutient l’endocytose médiée par les récepteurs, le flux autophagie–lysosome, la protéostasie et les voies de détection des nutriments, notamment la signalisation mTORC1 à la surface lysosomale. L’acidification dépendante d’ATP6V1E1 influence également le traitement des antigènes, le trafic membranaire et l’activité des enzymes sensibles au pH, reliant ce gène à des mécanismes fondamentaux d’homéostasie cellulaire. Une fonction dérégulée de la V-ATPase est associée à des altérations du trafic vésiculaire et à un dysfonctionnement lysosomal observés dans un large éventail de phénotypes cellulaires pertinents pour les maladies, notamment dans des contextes de neurodéveloppement et de stress métabolique.

ATP6E Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V1E1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP6E Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V1E1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V1E1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP6E. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V1E1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP6E au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP6E dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V1E1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.