ATP11B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411692-ACT

ATP11B kodiert eine P4-ATPase‑Phospholipid‑Flippase, die dazu beiträgt, die Lipidasymmetrie der Plasma- und Endomembranen aufrechtzuerhalten, indem sie aminophospholipide ATP‑abhängig über die Lipiddoppelschicht transloziert. Durch die Regulation von Membrankrümmung und der Zusammensetzung der beiden Membranblätter trägt ATP11B zur Vesikelknospung, zum endozytotischen Recycling sowie zu Golgi‑assoziierten Transportprozessen bei, die Proteinsortierung und zelluläre Polarität prägen. Veränderte Phospholipidtransporte und Membrandynamiken unter Beteiligung von ATP11B wurden in der Literatur mit Änderungen von Wirkstofftransport‑Phänotypen und Stressantworten in Tumorzellmodellen in Verbindung gebracht und stützen die Untersuchung von Mechanismen der Chemoresistenz und des intrazellulären Traffickings. Seine Aktivität überschneidet sich außerdem mit Signalwegen, die die Membranhomöostase, apoptosisbezogene Signale im Zusammenhang mit Lipid‑Scrambling und die Organellenfunktion steuern.

ATP11B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP11B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATP11B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP11B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP11B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATP11B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP11B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATP11B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATP11B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP11B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.