Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATG7: sc-400997-ACT

L’ATG7 humaine code une enzyme activatrice de type E1 essentielle à la macroautophagie, en catalysant des réactions de conjugaison de type ubiquitine indispensables à la biogenèse des autophagosomes. ATG7 active ATG12 et les protéines de la famille LC3/ATG8 afin de favoriser la formation du complexe ATG12–ATG5 et la lipidation de LC3, régulant ainsi la séquestration des cargos, le contrôle qualité des organites et l’adaptation au stress. Par son rôle central dans la protéostasie, l’homéostasie mitochondriale et les réponses de détection des nutriments, ATG7 influence des voies liées à l’inflammation, aux maladies neurodégénératives, à la biologie des infections et au métabolisme tumoral. Une autophagie dépendante d’ATG7 dérégulée a été associée à des modifications de la survie cellulaire et de la tolérance au stress, faisant d’ATG7 une cible largement étudiée dans la recherche sur l’autophagie et la dégradation lysosomale.

ATG7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATG7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATG7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATG7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATG7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATG7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATG7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATG7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATG7 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATG7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.