Atg4b CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404173-ACT

Humanes ATG4B kodiert Atg4b, eine Cysteinprotease, die die Prozessierung und Delipidierung von Proteinen der ATG8-Familie wie LC3 und GABARAP katalysiert und so deren Konjugation an Phosphatidylethanolamin sowie das Recycling von autophagosomalen Membranen ermöglicht. Durch diese Aktivitäten reguliert Atg4b die Biogenese und Reifung von Autophagosomen sowie den Cargofluss in der Makroautophagie und in selektiven Autophagiewegen. Die ATG4B-Funktion beeinflusst die Proteostase, die Qualitätskontrolle von Mitochondrien und anderen Organellen sowie zelluläre Antworten auf Nährstoffmangel und Hypoxie. Eine dysregulierte, ATG4B-abhängige Autophagie wurde in Zusammenhängen beschrieben, die für die Krebsbiologie, Neurodegeneration und Infektionen relevant sind, wobei ein veränderter Umsatz von Proteinaggregaten und geschädigten Organellen das Zellüberleben und inflammatorische Signalwege modulieren kann.

Atg4b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATG4B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Atg4b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATG4B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATG4B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Atg4b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATG4B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Atg4b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Atg4b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATG4B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.