Plasmide CRISPR d'Activation (h) Atg14: sc-402883-ACT

L’ATG14 humain code Atg14, un composant central du complexe I de la phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PI3KC3), qui favorise la production de phosphatidylinositol-3-phosphate au niveau des membranes autophagosomales naissantes. Atg14 contribue à spécifier l’initiation de l’autophagie en dirigeant le complexe Beclin 1–VPS34 vers le réticulum endoplasmique et les sites d’assemblage du phagophore, soutenant la nucléation et la maturation des autophagosomes. En contrôlant le flux autophagique et les voies de dégradation sélective, ATG14 influence la protéostasie, le contrôle qualité des organites et les réponses cellulaires au stress nutritionnel. Une autophagie dérégulée impliquant ATG14 a été associée à des mécanismes pertinents pour la biologie du cancer, la neurodégénérescence et la signalisation inflammatoire, ce qui en fait une cible utile pour l’étude des voies de signalisation.

Atg14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATG14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Atg14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATG14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATG14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Atg14. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATG14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Atg14 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Atg14 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATG14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.