Plasmide CRISPR d'Activation (h) Atg12: sc-401894-ACT

ATG12 humain code Atg12, un modificateur de type ubiquitine indispensable à l’autophagie grâce à sa conjugaison covalente à ATG5, formant le complexe ATG12–ATG5–ATG16L1 qui pilote l’expansion du phagophore et la biogenèse des autophagosomes. Cette machinerie soutient la protéostasie basale et l’adaptation au stress en permettant le renouvellement lysosomal des organites endommagés et des protéines agrégées, en interaction avec des voies de détection des nutriments telles que mTOR et AMPK. Une perturbation du flux autophagique régulé par ATG12 a été associée à une signalisation inflammatoire altérée, à une homéostasie cellulaire compromise et à des rôles dépendants du contexte dans la biologie tumorale et le stress protéotoxique lié à la neurodégénérescence. En tant que composant central de l’autophagie, ATG12 est largement utilisé pour étudier le dialogue entre le contrôle qualité des organites, les réponses immunitaires innées et le remodelage métabolique.

Atg12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATG12 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Atg12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATG12 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATG12, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Atg12. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATG12 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Atg12 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Atg12 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATG12 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.