Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATE1: sc-405539-ACT

ATE1 code l’arginyltransférase 1, une enzyme clé de la voie N-dégron (règle N-end), qui catalyse l’arginylation post-traductionnelle des protéines afin de générer des dégrons reconnus par des ligases de l’ubiquitine. En régulant le renouvellement des protéines médié par l’ubiquitine–protéasome, ATE1 influence l’homéostasie protéique, l’organisation du cytosquelette, la migration cellulaire et la signalisation adaptative au stress. L’arginylation dépendante d’ATE1 a également été associée au contrôle qualité des protéines mal repliées et à la modulation des réseaux de protéostase. Une signalisation N-dégron dérégulée et des dynamiques altérées de dégradation des protéines impliquant ATE1 sont étudiées dans des contextes tels que le comportement des cellules cancéreuses et le stress protéotoxique associé aux maladies neurodégénératives.

ATE1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATE1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATE1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATE1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATE1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATE1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATE1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATE1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATE1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATE1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.