Plasmide CRISPR d'Activation (h) ASPP1: sc-404330-ACT

PPP1R13B code pour ASPP1, un régulateur riche en proline qui se lie aux membres de la famille p53 et module des programmes transcriptionnels contrôlant l’apoptose, l’arrêt du cycle cellulaire et les réponses au stress cellulaire. ASPP1 agit à l’interface entre la signalisation des dommages à l’ADN et le contrôle transcriptionnel associé à la chromatine, influençant l’équilibre entre survie et mort cellulaire programmée. Une expression altérée de PPP1R13B ou une régulation médiée par ASPP1 a été associée à une activité dérégulée de la voie p53 observée dans divers contextes liés au cancer ainsi que dans d’autres troubles impliquant un contrôle apoptotique déficient. Ainsi, PPP1R13B/ASPP1 est fréquemment étudié dans les voies reliant le stress génotoxique, les réseaux de suppresseurs de tumeurs et le remodelage transcriptionnel.

ASPP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R13B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASPP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R13B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R13B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASPP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R13B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASPP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASPP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R13B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.