Asparagine synthetase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402240-ACT

Das humane ASNS-Gen kodiert die Asparaginsynthetase, ein zytosolisches Enzym, das die ATP-abhängige Umwandlung von Aspartat und Glutamin zu Asparagin und Glutamat katalysiert und damit die Aminosäurehomöostase mit dem Stickstoffstoffwechsel verknüpft. Die ASNS-Expression wird durch Nährstoff- und Stresssignale reguliert, darunter die Integrated Stress Response (ISR) und die Amino-Acid-Response(AA)-Signalwege, und kann die Proteinsynthesekapazität bei metabolischer Limitierung beeinflussen. Eine veränderte ASNS-Aktivität wird mit zellulärer Anpassung an Nährstoffmangel und Veränderungen der proliferativen Fitness in Verbindung gebracht. Erbliche Loss-of-Function-Varianten in ASNS stehen mit einem ASNS-Mangel in Zusammenhang, einer neurodevelopmentalen Erkrankung mit beeinträchtigter Gehirnentwicklung, was die Bedeutung des Gens für die Aminosäurebalance des Organismus unterstreicht.

Asparagine synthetase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ASNS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Asparagine synthetase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ASNS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ASNS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Asparagine synthetase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ASNS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Asparagine synthetase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Asparagine synthetase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ASNS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.