ASF1A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404071-ACT

ASF1A kodiert die Anti-Silencing-Funktion 1A, ein konserviertes Histon‑H3/H4‑Chaperon, das während DNA-Replikation, Transkription und DNA-Schadensreparatur den Auf- und Abbau von Nukleosomen koordiniert. Durch die Zusammenarbeit mit Chromatinregulatoren wie CAF‑1 und HIRA unterstützt ASF1A die replikationsgekoppelte Wiederherstellung des Chromatins, die Dynamik der Histonbereitstellung und die Aufrechterhaltung epigenetischer Zustände über den Zellzyklus hinweg. Eine veränderte ASF1A-Aktivität kann Programme zur Genomstabilität und die Chromatinzugänglichkeit stören, wodurch dieser Faktor mit dysregulierter Proliferation und Stressantworten in Verbindung steht, wie sie bei Krebs und anderen Erkrankungen mit Defekten im Chromatin-Remodeling beobachtet werden. Als zentraler Knotenpunkt der Chromatin-Homöostase wird ASF1A häufig in Signalwegen untersucht, die Replikationsstress, Checkpoint-Signalgebung und transkriptionelle Reprogrammierung steuern.

ASF1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ASF1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASF1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ASF1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ASF1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASF1A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ASF1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASF1A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASF1A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ASF1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.