Plasmide CRISPR d'Activation (h) ASF1A: sc-404071-ACT

ASF1A code la protéine anti-silencing function 1A, un chaperon d’histones H3–H4 conservé qui coordonne l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes lors de la réplication de l’ADN, de la transcription et de la réparation des dommages à l’ADN. En s’associant à des régulateurs de la chromatine tels que CAF-1 et HIRA, ASF1A contribue à la réassemblage de la chromatine couplé à la réplication, à la dynamique de l’approvisionnement en histones et au maintien des états épigénétiques tout au long du cycle cellulaire. Une activité altérée d’ASF1A peut perturber les programmes de stabilité du génome et l’accessibilité de la chromatine, reliant ce facteur à la prolifération dérégulée et aux réponses au stress observées dans le cancer et d’autres maladies présentant des défauts de remodelage de la chromatine. En tant que nœud central de l’homéostasie de la chromatine, ASF1A est fréquemment étudiée dans les voies qui gouvernent le stress réplicatif, la signalisation des points de contrôle et la reprogrammation transcriptionnelle.

ASF1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ASF1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASF1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ASF1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ASF1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASF1A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ASF1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASF1A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASF1A dans les cellules tumorales présentant une expression de ASF1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.