Plasmide CRISPR d'Activation (m) ASCL3: sc-425304-ACT

Le facteur de transcription 3 de la famille achaete-scute, à domaine bHLH (ASCL3), est un régulateur murin de type hélice-boucle-hélice basique impliqué dans la spécification des lignages et les programmes de différenciation, en particulier dans les contextes épithéliaux et des cellules sécrétoires. En se liant à des motifs E-box et en coordonnant des réseaux transcriptionnels avec d’autres facteurs bHLH, ASCL3 peut influencer les décisions de destinée cellulaire, la maturation et le maintien de phénotypes cellulaires spécialisés. Une expression dérégulée des régulateurs développementaux bHLH est fréquemment associée à des états de différenciation altérés, à une prolifération aberrante et à une reprogrammation transcriptionnelle en lien avec des processus oncogéniques et métaplasiques. Ascl3 constitue donc un nœud utile pour disséquer les voies de développement pilotées par des facteurs de transcription et les changements d’expression génique associés à la différenciation dans des systèmes modèles murins.

ASCL3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ascl3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASCL3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ascl3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ascl3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASCL3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ascl3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASCL3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASCL3 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ascl3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.