ARP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405241-ACT

NR2F2 kodiert den menschlichen verwaisten nukleären Rezeptor ARP-1 (COUP-TFII), einen ligandenunabhängigen Transkriptionsfaktor, der an Hormon-Response-Elemente bindet, um Genprogramme zu koordinieren, die Zellschicksal, Angiogenese und metabolische Anpassung steuern. ARP-1 ist in die Signalwege nukleärer Rezeptoren sowie in chromatinregulatorische Netzwerke eingebunden und moduliert dadurch Entwicklungs-Musterbildung, epithelial–mesenchymale Transitionen und die vaskuläre Spezifizierung. Eine dysregulierte NR2F2-Expression wurde mit veränderten Differenzierungszuständen und transkriptioneller Reprogrammierung in Verbindung gebracht, wie sie bei angeborenen kardiovaskulären Phänotypen und in mehreren krebsrelevanten Signalwegen beobachtet werden. In zellbasierten Modellen wird ARP-1 häufig hinsichtlich seiner Rollen bei der Enhancer-Auswahl, der linienspezifischen transkriptionellen Schaltkreise und des Crosstalks mit Steroid- und Retinoidrezeptor-Signalwegen untersucht.

ARP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NR2F2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NR2F2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NR2F2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NR2F2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NR2F2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.