Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARP-1: sc-405241-ACT

NR2F2 code pour le récepteur nucléaire orphelin humain ARP-1 (COUP-TFII), un facteur de transcription indépendant d’un ligand qui se lie à des éléments de réponse hormonale afin de coordonner des programmes géniques contrôlant le destin cellulaire, l’angiogenèse et l’adaptation métabolique. ARP-1 s’intègre aux voies de signalisation des récepteurs nucléaires et aux réseaux de régulation de la chromatine pour moduler la mise en place des patrons développementaux, les transitions épithélio-mésenchymateuses et la spécification vasculaire. Une expression dérégulée de NR2F2 a été associée à des états de différenciation altérés et à une reprogrammation transcriptionnelle observés dans des phénotypes cardiovasculaires congénitaux ainsi que dans de multiples voies pertinentes pour le cancer. Dans des modèles cellulaires, ARP-1 est couramment étudié pour ses rôles dans la sélection des enhancers, les circuits transcriptionnels spécifiques de lignée et les interactions croisées avec les voies des récepteurs aux stéroïdes et aux rétinoïdes.

ARP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NR2F2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NR2F2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NR2F2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARP-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NR2F2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARP-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARP-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NR2F2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.