Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARFGAP1: sc-403939-ACT

ARFGAP1 code la protéine d’activation de la GTPase du facteur d’ADP-ribosylation 1 (ARF GTPase-activating protein 1), un régulateur clé du cycle d’ARF1 qui favorise l’hydrolyse du GTP afin de coordonner le bourgeonnement et le désassemblage des vésicules dans la voie sécrétoire précoce. En modulant le transport médié par COPI, le trafic Golgi–RE et la dynamique de la courbure membranaire, ARFGAP1 contribue au maintien de la structure du Golgi et à un tri efficace des cargaisons. Son activité s’inscrit à l’interface de la signalisation des petites GTPases et de réseaux plus larges de trafic membranaire qui influencent le recyclage des récepteurs et l’intensité de la signalisation intracellulaire. La dérégulation du trafic dépendant d’ARF et de l’homéostasie du Golgi a été associée à des phénotypes pertinents pour la signalisation oncogénique, la neurodégénérescence et l’exploitation, par des agents pathogènes, de la machinerie de transport de l’hôte, ce qui fait d’ARFGAP1 un nœud utile pour des études mécanistiques.

ARFGAP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARFGAP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARFGAP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARFGAP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARFGAP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARFGAP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARFGAP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARFGAP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARFGAP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ARFGAP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.