Plasmide CRISPR d'Activation (h) Aquaporin 0/AQP0: sc-403852-ACT

MIP code pour l’aquaporine 0 (AQP0), la principale protéine intrinsèque membranaire des cellules des fibres du cristallin. Elle agit comme un canal hydrique à faible perméabilité et comme une molécule d’adhérence favorisant une apposition étroite fibre–fibre. En régulant l’homéostasie hydrique du cristallin et en contribuant à l’organisation membranaire, AQP0 aide à maintenir la transparence du cristallin et ses propriétés réfractives via des processus liés à l’équilibre osmotique, à l’architecture des jonctions et à la protéostasie. Son activité est modulée par des modifications post-traductionnelles et des interactions avec des composants du cytosquelette et des jonctions du cristallin, qui façonnent la maturation des cellules fibreuses. Une dérégulation ou des mutations de MIP sont associées à des cataractes héréditaires et à des défauts de la micro-architecture du cristallin, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du développement du cristallin, de l’agrégation protéique et de la physiologie des barrières.

Aquaporin 0/AQP0 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MIP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Aquaporin 0/AQP0 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MIP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MIP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Aquaporin 0/AQP0. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MIP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Aquaporin 0/AQP0 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Aquaporin 0/AQP0 dans les cellules tumorales présentant une expression de MIP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.