Plasmide CRISPR d'Activation (h) APOBEC3G: sc-402769-ACT

L’APOBEC3G humain est une désaminase de cytidine qui restreint les rétrovirus et les rétrotransposons en introduisant des modifications C→U dans l’ADN simple brin lors de la rétrotranscription, favorisant une mutagenèse létale des génomes viraux. Il agit au sein de l’immunité innée intrinsèque et s’articule avec les programmes de gènes stimulés par l’interféron ainsi qu’avec les voies de détection des acides nucléiques qui façonnent la défense antivirale. L’activité d’APOBEC3G est contrecarrée par des antagonistes viraux tels que Vif du VIH-1, faisant de sa régulation un enjeu central dans l’étude des interactions hôte–pathogène et de l’évolution virale. Une activité dérégulée des désaminases de la famille APOBEC a également été associée à l’instabilité du génome et à des signatures mutationnelles pertinentes en biologie du cancer et dans des contextes inflammatoires.

APOBEC3G Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de APOBEC3G sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

APOBEC3G Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus APOBEC3G dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription APOBEC3G, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de APOBEC3G. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus APOBEC3G natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de APOBEC3G au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie APOBEC3G dans les cellules tumorales présentant une expression de APOBEC3G silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.