Apg-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403942-ACT

HSPA4L kodiert Apg-1, ein Mitglied der HSP70-Familie ATP-abhängiger molekularer Chaperone, das die Proteostase unterstützt, indem es die Faltung von Client-Proteinen fördert, Aggregation verhindert und die Erholung von zellulärem Stress erleichtert. Apg-1 ist an zytoprotektiven Hitzeschockantworten beteiligt und koordiniert Qualitätskontrollwege, die mit dem Ubiquitin-Proteasom-Abbau und der Autophagie verknüpft sind, wodurch die Protein-Homöostase bei oxidativem Stress, Hitzestress und ER-Stress aufrechterhalten wird. Da ein Ungleichgewicht der Proteostase ein häufiges Merkmal von Krebs, Neurodegeneration und anderen stressassoziierten Pathologien ist, wird eine veränderte HSPA4L-Aktivität in Kontexten untersucht, in denen Chaperon-Kapazität, Proteinfehlfaltung und Stressanpassung Schicksalsentscheidungen von Zellen beeinflussen. Menschliches Apg-1 dient außerdem als nützliches Modell, um das Crosstalk innerhalb des HSP70-Netzwerks mit Signal-Knotenpunkten zu untersuchen, die Stresswahrnehmung mit Apoptose, Zellzykluskontrolle und metabolischer Umprogrammierung koppeln.

Apg-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSPA4L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Apg-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSPA4L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSPA4L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Apg-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSPA4L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Apg-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Apg-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSPA4L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.