Plasmide CRISPR d'Activation (h) AP4A Hydrolase: sc-407028-ACT

NUDT2 code pour l’hydrolase humaine de l’Ap4A, une enzyme de la famille Nudix qui hydrolyse le tétraphosphate de diadénosine (Ap4A) et des dinucléosides polyphosphates apparentés, régulant ainsi les réserves intracellulaires de nucléotides « alarmones ». En contrôlant le renouvellement (turnover) de l’Ap4A, l’hydrolase AP4A influence la signalisation nucléotidique liée aux réponses au stress cellulaire, à l’équilibre redox et à la coordination des programmes transcriptionnels et prolifératifs. L’activité de NUDT2 s’inscrit à l’interface de voies plus larges du métabolisme des purines et de l’homéostasie des nucléotides, susceptibles d’influencer le traitement de l’ADN/ARN et la dynamique du cycle cellulaire. Des dérégulations du métabolisme des dinucléosides polyphosphates ainsi que des modifications des profils d’expression de NUDT2 ont été rapportées dans des contextes associés à des maladies, ce qui soutient son intérêt en tant que nœud mécanistique pour étudier la signalisation d’adaptation au stress dans les cellules humaines.

AP4A Hydrolase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NUDT2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AP4A Hydrolase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NUDT2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NUDT2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AP4A Hydrolase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NUDT2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AP4A Hydrolase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AP4A Hydrolase dans les cellules tumorales présentant une expression de NUDT2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.