AP4A Hydrolase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407028-ACT

NUDT2 kodiert die humane Ap4A-Hydrolase, ein Enzym der Nudix-Familie, das Diadenosintetraphosphat (Ap4A) und verwandte Dinukleosid-Polyphosphate hydrolysiert und dadurch die intrazellulären „Alarmon“-Nukleotidpools reguliert. Durch die Kontrolle des Ap4A-Umsatzes beeinflusst die Ap4A-Hydrolase die Nukleotidsignalgebung, die mit zellulären Stressantworten, dem Redoxgleichgewicht sowie der Koordination von Transkriptions- und Proliferationsprogrammen verknüpft ist. Die NUDT2-Aktivität greift in breitere Signalwege des Purinstoffwechsels und der Nukleotidhomöostase ein, die die DNA-/RNA-Verarbeitung und die Dynamik des Zellzyklus prägen können. Eine dysregulierte Dinukleosid-Polyphosphat‑Metabolisierung und veränderte NUDT2-Expressionsmuster wurden in krankheitsassoziierten Kontexten beschrieben, was seine Eignung als mechanistischer Knotenpunkt für die Untersuchung stressadaptiver Signalgebung in menschlichen Zellen untermauert.

AP4A Hydrolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NUDT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AP4A Hydrolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NUDT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NUDT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AP4A Hydrolase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NUDT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AP4A Hydrolase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AP4A Hydrolase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NUDT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.