Plasmide CRISPR d'Activation (h) AOF1: sc-405078-ACT

Le gène humain KDM1B (AOF1) code une déméthylase de la lysine dépendante du FAD qui élimine préférentiellement les marques H3K4me1/2 afin de moduler l’accessibilité de la chromatine et la production transcriptionnelle. En modulant les états de méthylation des histones, AOF1 contribue à la régulation épigénétique des programmes d’identité cellulaire, notamment la différenciation, la stabilité du génome et le contrôle transcriptionnel de la lignée germinale ou des stades précoces du développement. L’activité de KDM1B s’interface avec des réseaux plus larges de remodelage de la chromatine et de répression/activation transcriptionnelle, influençant des voies qui gouvernent la prolifération et l’engagement de lignée. Une déméthylation aberrante des histones et des profils d’expression altérés de KDM1B ont été associés à des déséquilibres épigénétiques observés dans de multiples contextes pertinents pour la maladie, notamment les cancers et certains phénotypes développementaux.

AOF1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KDM1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AOF1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KDM1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KDM1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AOF1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KDM1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AOF1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AOF1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KDM1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.