Annexin V Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400836-ACT

L’ANXA5 umano codifica l’annessina V, una proteina legante i fosfolipidi dipendente dal Ca2+ che si associa preferenzialmente alla fosfatidilserina nelle membrane cellulari e riorganizza i microdomini di membrana. L’annessina V partecipa al traffico di membrana, alla segnalazione dipendente dai fosfolipidi e alla regolazione delle superfici correlate alla coagulazione, ed è ampiamente utilizzata come readout molecolare dell’esternalizzazione della fosfatidilserina durante l’apoptosi. Attraverso i suoi ruoli nella dinamica di membrana regolata dal calcio, l’annessina V è collegata a processi che includono la fusione di vescicole, le risposte allo stress cellulare e la segnalazione infiammatoria. Un’espressione o una localizzazione deregolate di ANXA5 sono state studiate in contesti quali la biologia della trombosi, fenotipi autoimmuni e programmi di sopravvivenza delle cellule tumorali, a supporto della sua utilità come nodo meccanicistico nelle vie associate alla membrana.

Annexin V Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANXA5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Annexin V Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANXA5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANXA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Annexin V. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANXA5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Annexin V nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Annexin V nelle cellule tumorali con espressione di ANXA5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.