ANKRD50 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412772-ACT

Das humane Gen **ANKRD50** kodiert ein Ankyrin-Repeat-haltiges Protein, das an endosomalem Transport und der Sortierung von Membranproteinen beteiligt ist und damit die räumliche Kontrolle von Signalrezeptoren und Transportern unterstützt. Beschriebene Funktionen verknüpfen ANKRD50 mit endosomenassoziierten regulatorischen Netzwerken, die das Rezeptor-Recycling, die Vesikeldynamik und die Feinabstimmung nachgeschalteter Signalwege beeinflussen, einschließlich Prozessen, die Ausgänge von Wachstumsfaktor- und Immunsignalen modulieren. Durch diese Rollen ist ANKRD50 für Studien zur zellulären Homöostase, Proteostase und zur Zuverlässigkeit der Signaltransduktion in differenzierten und proliferativen Kontexten relevant. Verändertes endomembranales Trafficking ist ein häufiges Merkmal bei mehreren Krankheitsmechanismen, wodurch ANKRD50 ein nützliches Ziel ist, um zu untersuchen, wie Störungen des Traffickings zelluläre Signalzustände verändern.

ANKRD50 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ANKRD50-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANKRD50 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ANKRD50-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ANKRD50-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANKRD50-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ANKRD50-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANKRD50-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANKRD50-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ANKRD50-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.