Plasmide CRISPR d'Activation (h) ANKFY1: sc-406658-ACT

ANKFY1 humain (ankyrin repeat and FYVE domain containing 1) code un adaptateur associé aux membranes, impliqué dans le trafic endosomal et la dynamique des endosomes précoces dépendante de Rab5, via l’interaction de son domaine FYVE avec le phosphatidylinositol-3-phosphate. En coordonnant le tri du cargo, le recyclage des récepteurs et la maturation des endosomes, ANKFY1 contribue à une régulation fine des signaux émis par les récepteurs internalisés et peut influencer des voies d’homéostasie cellulaire liées à la signalisation des facteurs de croissance et à la détection des nutriments. Un transport endocytaire dérégulé est une caractéristique récurrente en biologie du cancer et dans les maladies neurodégénératives, ce qui fait d’ANKFY1 un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la signalisation médiée par les vésicules et de la protéostasie. Son architecture en domaines se prête également à l’étude de la liaison aux phosphoinositides, des interactions protéine‑protéine médiées par les répétitions ankyrine, et de la régulation compartiment‑spécifique des complexes de trafic.

ANKFY1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ANKFY1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ANKFY1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ANKFY1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ANKFY1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ANKFY1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ANKFY1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ANKFY1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ANKFY1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ANKFY1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.