ANAPC2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404962-ACT

Das humane ANAPC2 kodiert eine zentrale Gerüstuntereinheit des Anaphase-Promoting-Complex/Cyclosom (APC/C), einer aus mehreren Untereinheiten bestehenden E3-Ubiquitin-Ligase, die den mitotischen Ablauf vorantreibt, indem sie zentrale Zellzyklusregulatoren für den proteasomalen Abbau markiert. Durch die koordinierte Ubiquitinierung von Substraten wie Securin und Cyclinen steuert der APC/C den Übergang von der Metaphase zur Anaphase, den Austritt aus der Mitose sowie die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Die Funktion von ANAPC2 überschneidet sich mit der Signalgebung des Spindelaufbau-Kontrollpunkts (spindle assembly checkpoint) und der ubiquitinabhängigen Proteostase und verknüpft damit das Timing des Zellzyklus mit einer korrekten Chromosomensegregation. Eine Fehlregulation von APC/C-Komponenten, einschließlich Störungen in ANAPC2-assoziierten Netzwerken, wird häufig im Zusammenhang mit Aneuploidie, Replikationsstress und proliferativen Krankheitsmechanismen untersucht, die für die Krebsbiologie relevant sind.

ANAPC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ANAPC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANAPC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ANAPC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ANAPC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANAPC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ANAPC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANAPC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANAPC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ANAPC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.