Plasmide CRISPR d'Activation (h) ANAPC2: sc-404962-ACT

ANAPC2 humain code une sous-unité centrale d’échafaudage du complexe promoteur de l’anaphase/cyclosome (APC/C), une ligase E3 de l’ubiquitine multisous-unités qui pilote la progression mitotique en ciblant des régulateurs clés du cycle cellulaire pour leur dégradation par le protéasome. Par l’ubiquitination coordonnée de substrats tels que la sécurine et les cyclines, l’APC/C contrôle la transition métaphase–anaphase, la sortie de mitose et le maintien de la stabilité génomique. La fonction d’ANAPC2 interfère avec la signalisation du point de contrôle d’assemblage du fuseau et avec la protéostasie dépendante de l’ubiquitine, reliant la synchronisation du cycle cellulaire à une ségrégation correcte des chromosomes. La dérégulation des composants de l’APC/C, y compris les perturbations du réseau associé à ANAPC2, est fréquemment étudiée dans le contexte de l’aneuploïdie, du stress de réplication et de mécanismes de maladies prolifératives pertinents pour la biologie des cancers.

ANAPC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ANAPC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ANAPC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ANAPC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ANAPC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ANAPC2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ANAPC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ANAPC2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ANAPC2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ANAPC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.