Plasmide CRISPR d'Activation (h) AMPKγ1: sc-418058-ACT

PRKAG1 code la sous-unité régulatrice γ1 de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), un capteur central de l’énergie cellulaire qui couple les variations des rapports AMP/ADP sur ATP à une reprogrammation du métabolisme. AMPKγ1 contribue à la liaison des nucléotides et à la régulation allostérique du complexe AMPK, influençant un contrôle, dépendant de la phosphorylation, de la captation du glucose, de l’oxydation des acides gras, de la biogenèse mitochondriale et de l’autophagie. Grâce à son intégration avec mTORC1, la signalisation de l’insuline et les voies de réponse au stress, l’activité d’AMPK aide à coordonner la croissance cellulaire avec la disponibilité en nutriments. Une signalisation AMPK dérégulée et une expression altérée de PRKAG1 ont été associées à des dysfonctionnements métaboliques et pourraient moduler l’adaptation des cellules tumorales au stress énergétique, faisant de PRKAG1 une cible utile pour des études mécanistiques de bioénergétique.

AMPKγ1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKAG1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AMPKγ1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKAG1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKAG1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AMPKγ1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKAG1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AMPKγ1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AMPKγ1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKAG1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.