Plásmido CRISPR de Activación (h) AMPKβ1: sc-402952-ACT

PRKAB1 codifica la subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), un sensor central de la energía celular que coordina la homeostasis metabólica en respuesta a señales de nutrientes y de estrés. AMPKβ1 favorece el ensamblaje y la estabilidad del heterotrímero de AMPK y contribuye al direccionamiento hacia sustratos y a la localización subcelular, influyendo así en programas de fosforilación que controlan la captación de glucosa, la oxidación de ácidos grasos, la biogénesis mitocondrial, la autofagia y la señalización de mTORC1. A través de estas vías, AMPKβ1 influye en las decisiones de crecimiento celular, el equilibrio redox y la adaptación a la hipoxia y al estrés energético. La desregulación de la señalización de AMPK se ha asociado con trastornos metabólicos, inflamación y fenotipos relevantes para el cáncer, lo que convierte a PRKAB1 en un nodo útil para estudios mecanísticos de redes de señalización dependientes de la energía.

AMPKβ1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRKAB1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AMPKβ1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRKAB1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRKAB1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AMPKβ1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRKAB1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AMPKβ1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AMPKβ1 en células tumorales con expresión de PRKAB1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.