Plasmide CRISPR d'Activation (h) AMPK alpha 2: sc-400277-ACT

PRKAA2 code la sous-unité catalytique α2 de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), un capteur énergétique central qui maintient l’homéostasie de l’ATP cellulaire en réponse au stress métabolique. AMPKα2 intègre des signaux en amont provenant de LKB1 et de CaMKK2 afin de réguler l’absorption du glucose, l’oxydation des lipides, la biogenèse mitochondriale et l’autophagie, via des voies comprenant notamment l’inhibition de mTORC1 et l’activation d’ULK1. Dans les tissus humains, l’activité d’AMPKα2 est étroitement liée à la détection des nutriments et à l’équilibre redox, avec une large pertinence pour la dérégulation métabolique, l’inflammation et les phénotypes d’adaptation au stress observés dans des contextes cardiométaboliques et associés à la neurodégénérescence. Moduler l’expression de PRKAA2 est donc utile pour disséquer la manière dont la signalisation du stress énergétique remodèle les programmes transcriptionnels et les décisions de destinée cellulaire.

AMPK alpha 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKAA2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AMPK alpha 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKAA2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKAA2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AMPK alpha 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKAA2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AMPK alpha 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AMPK alpha 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKAA2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.