AMPD2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430952-ACT

Mouse Ampd2 kodiert die Adenosinmonophosphat-Deaminase 2 (AMPD2), ein Enzym, das im Purinnukleotidzyklus die Desaminierung von AMP zu IMP katalysiert und dadurch die adenylate Energieladung sowie das Gleichgewicht der Nukleotidpools beeinflusst. Über die Regulation der AMP/ATP-Homöostase ist die AMPD2-Aktivität in eine umfassendere metabolische Kontrolle eingebunden, darunter AMPK-gekoppelte Energiesensorik, der glykolytische Fluss und die stressresponsive Purin-Salvage. Störungen der AMP-Desaminierung können intrazelluläres IMP und nachgeschaltete Purinmetabolite verschieben und damit Programme der Zellproliferation und -differenzierung beeinflussen, die von der Verfügbarkeit von Nukleotiden abhängen. Eine fehlregulierte, AMPD2-assoziierte Nukleotidmetabolisierung wurde mit neurometabolischer Vulnerabilität und weiteren Erkrankungen in Verbindung gebracht, bei denen Energiebilanz und Purinumsatz eine Rolle spielen, was AMPD2 als mechanistischen Knotenpunkt für Studien zu metabolischen und neuronalen Signalwegen unterstützt.

AMPD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ampd2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMPD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ampd2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ampd2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMPD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ampd2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMPD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMPD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ampd2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.