Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ameloblastin: sc-403086-ACT

AMBN code l’améloblastine, une glycoprotéine sécrétée de la matrice extracellulaire fortement enrichie lors de la formation de l’émail, qui contribue à l’adhésion des améloblastes, à leur polarité et à un dépôt minéral contrôlé. L’améloblastine participe à la signalisation matrice–cellule et coordonne la différenciation de l’organe de l’émail en modulant l’organisation de la matrice extracellulaire ainsi que les programmes épithéliaux de développement associés. Au-delà de ses rôles dans la morphogenèse dentaire, l’expression d’AMBN a été associée à la régulation de la migration et de la différenciation cellulaires dans des contextes de tissus minéralisés, ce qui la rend pertinente pour les études du développement craniofacial et de l’intégrité structurelle de l’émail. Une activité ou une expression dérégulée d’AMBN présente donc un intérêt pour l’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des défauts de l’émail et, plus largement, des interactions épithélium–matrice.

Ameloblastin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AMBN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ameloblastin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AMBN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AMBN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ameloblastin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AMBN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ameloblastin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ameloblastin dans les cellules tumorales présentant une expression de AMBN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.